Metoda měření chemiluminiscence světloemitujících bakterií

V první části studie byla jako modelový organismus zvolena bakterie Photorhabdus (=Xenorhabdus) luminescens, na kterou se působilo budiči jednak impulsního magnetického pole a jednak budiči pole IVMP. Jedná se o G^- tyčkovitou, luminiscenční, pohyblivou bakterii, velmi variabilní, velikosti v rozmezí od 2 x 0,5 do 10 x 2 µm. Tento druh je jediná terestrická svítící bakterie, všechny ostatní druhy s vlastní luminiscencí jsou mořské. Žije volně v půdě nebo v symbióze s entomopatogenními hlístovkami, kde se nachází monoxenicky v celém střevě invazních larev hlístovek rodu Heterorhabditis, které jim zajišťují ochranu a transport. Charakteristika luminiscence je velmi podobná mořským bakteriím (maximum při 490 nm). Kultury mohou růst exponenciálně (pro zdvojení počtu bakterií při 30°C je třeba 1,5 hodiny), ve stacionární fázi růstu je luminiscence největší [4].

Celkem existuje 11 druhů bakterií s vlastní luminiscencí (bioluminiscencí) ve 4 rodech [Vibrio, Photobacterium, Shewanella (Alteromonas) a Xenorhabdus (Photorhabdus)]. Luminiscence je závislá na aktivitě pěti genů zodpovědných za syntézu podjednotek luciferázy a komplexu reduktázy mastných kyselin, která zajišťuje recyklaci mastných kyselin na aldehyd. Reakcí bakteriálního luciferinu (redukovaného riboflavin fosfátu - FMNH₂) s aldehydem a luciferázou v přítomnosti kyslíku vznikne oxidovaná forma riboflavinu a mastná kyselina.
Současně je emitováno světlo podle vztahu

FMNH₂ + RCHO + O₂ --> FMN + H₂O + RCOOH + hv (490 nm)

(2)

Tato reakce je velmi citlivá na chemické, fyzikální a biologické faktory vnějšího prostředí, které mohou ovlivňovat buněčné dýchání, syntézu proteinů a lipidů, buněčnou integritu a správnou funkci biologických membrán. Proto jsou bakterie s přirozenou luminiscencí využívány k rychlé detekci přítomnosti polutantů i k cílenému studiu biologických účinků vnějších faktorů. Speciální aplikátor, přizpůsobený tvarům do matice uspořádaných miniaturních Petriho misek, 96 jamkových kultivačních desek, dovoloval soustředění vyzařované energie téměř bezprostředně do testovaného media. Výsledkem pokusů bylo zjištění, že u všech typů budičů impulsního magnetického a IVMP pole existuje statisticky prokazatelné ovlivnění buněčného materiálu. Budiči impulsního magnetického pole jsou vzduchové cívky a budiči pole IVMP jsou toroidy s feritovými jádry.

Materiál a metodika

Byla vybrána typová kultura bakterií druhu Photorhabdus luminescens subsp. akhurstii CCM7075. Bakterie byly kultivovány 48 hodin v tekutém médiu (Brain Heart Infusion, Pepton, NaCl, H₂O) při 28°C. Jejich koncentrace byla stanovena na spektrofotometru Spekol 11 při vlnové délce 400 nm, pro označení „blank“ bylo použito zmíněné tekuté médium (optická hustota = 1.0). Pro ozařování a následné měření bioluminiscence BL (Biological Luminiscence) byly do 96 jamek kultivační desky pipetovány stejné objemy bakteriální suspenze 50 µl a následně byl objem všech jamek doplněn na 250 µl pomocí tzv. Hanksova roztoku, HBSS (Hank’s Balanced Salt Solution). V následujících grafech je plnou čarou označena kontrolní neozářená suspenze bakterií a přerušovanou čarou je označena testovaná ozářená suspenze. Bioluminiscence bakterií byla měřena ve všech 96 jamkách kultivačních desek při laboratorní teplotě na luminometru LM 01T (Immunotech) v jednohodinových časových intervalech až do 8. hodiny po ozáření. Naměřená BL je přitom vyjádřena v relativních světelných jednotkách RLU (Relative Luminiscence Unit), z naměřených hodnot byly sestrojeny kinetické křivky reprezentující růstové křivky bakterií. Ozařování biologického materiálu ve všech případech mělo trvání vždy 15 minut před zahájením pokusu. První bod v následujících grafech je měření BL v čase 0 (tj. těsně po působení impulsního magnetického nebo IVMP pole). V průběhu pokusů touto metodou byly testovány i jiné koncentrace bakterií.

Studium vlivu impulsního magnetického pole. Výsledkem měření je graf závislosti svítivé plochy bakterií Photorhabdus luminescens na čase. Velikost impulsní magnetické indukce B_imp≈10 mT, kmitočet impulsů f=15 Hz, šířka impulsů T=1 ms, resistance cívek R = 10Ω, I_imp = 0,7 A, těsná blízkost budičů od testované suspenze bakterií.

Obr. 2 Změna svítivosti bakterií Photorhabdus luminescens ovlivněných impulsním magnetickým polem vzduchové cívky.

Studium vlivu pole IVMP. Na následujícím obrázku je graf závislosti svítivé plochy bakterií Photorhabdus luminescens na čase. Kmitočet impulsů f=15 Hz, šířka impulsů T=1 ms, resistance cívek R = 2Ω, I_imp = 0,7 A, těsná blízkost budičů od testované suspenze bakterií.

Obr. 3 Změna svítivosti bakterií Photorhabdus luminescens ovlivněných polem IVMP generovaným toroidní cívkou s feritovým jádrem.

Zhodnocení: I když impulsní magnetické pole vzduchové cívky je z principu doprovázeno polem impulsního vektorového magnetického potenciálu, je příznivý účinek magnetického pole na bioaktivitu použitých bakterií zřejmě převažující. Po osmi hodinách po ozáření vykazovala svítivá plocha ozářených bakterií svítivost vyšší o 17500 RLU. Pokud byly stejné koncentrace bakterií za stejných okolních podmínek ozařovány jen polem IVMP generovaným toroidními cívkami s feritovými jádry (příkon pouze 20%, vnější magnetické pole neměřitelné), došlo ke zpomalení jejich životních funkcí a osm hodin po ozáření vykazovaly tyto svítivost menší přibližně o 5000 RLU než u kontrolního neozářeného vzorku. Toto počáteční zjištění vedlo k rozšíření pokusů na jiné typy buněčného materiálu pomocí dalších biofyzikálních metod.

nahoru