Metoda měření inhibice růstu a stanovení buněčné apoptózy a nekrózy

Test inhibice růstu (WST-1 test). Podstatou metody [8] je štěpení tetrazoliové soli mitochondriálními enzymy dehydrogenázami za vzniku barevného a nerozpustného formazanu. Jeho vznik a množství přímo koreluje s počtem metabolicky aktivních buněk (tj. živých = vitálních buněk) a byl stanoven spektrofotometrem (ELISA reader). Výsledkem je porovnání absorbance kontrolních buněk s absorbancí buněk ozářených některým z polí podle vztahu

kde
A (V24) - absorbance ozářeného vzorku inkubovaného po dobu t=24 h (resp. t=48 nebo 72h),
A (K0) - absorbance kontrolního vzorku v čase t=0 h (v době počátku experimentu),
A (K24) - absorbance kontrolního vzorku v čase t=24 h (resp. t=48 nebo 72 h),

přičemž

Stanovení buněčné apoptózy a nekrózy. Metoda je založena na kvantitativním sendvičovém imunotestu. Stanovuje mononukleosomy a oligonukleosomy v buněčných lyzátech a v kultivačním médiu po růstu buněk. Tím umožňuje stanovení buněk procházejících pozdním stadiem apoptózy (buněčné lyzáty) a buněk rozpadlých nekrózou (kultivační médium). Množství mono- a oligonukleosomů je vyjádřeno tzv. “enrichment“ faktorem EF, který se vypočítá z následujícího vzorce

(5)

přičemž EF do 1,3 se považuje za negativní.

Materiál a metodika

WST-1 test. Při sledování inhibice růstu se antiproliferační účinek pole IVMP vždy testoval vysetím vybrané buněčné kultury do 96 jamek kultivační desky v počtu 3 000, 2 000 a 1 000 buněk na jamku (tj. 3 různé koncentrace buněk v jednom pokusu, pro každou koncentraci minimálně 5 jamek). Druhý den po výměně kultivačního média v příslušných jamkách se buňky ozařovaly pouze polem IVMP vždy po dobu 15 minut. Druhá kultivační deska se stejným počtem buněk sloužila jako kontrolní. Růst buněk v deskách ozářených a v příslušných kontrolních kultivačních deskách se stanovoval v intervalech 24, 48 a 72 hod. po ozáření pomocí kitu WST-1 (Cell Proliferation Reagent WST-1; Roche, Mannheim, Německo).

Stanovení buněčné apoptózy a nekrózy. Zde byly buňky přeneseny do dvou kultivačních desek s 96 jamkami v koncentraci 5 000 buněk na jamku. Druhý den, po inkubaci při 37°C v atmosféře s 5 % CO₂ a výměně média, se buňky ozařovaly vždy po dobu 15 minut. V druhé kontrolní kultivační desce zůstaly buňky neozářené. Po další 4 resp. 16 hodinové inkubaci bylo provedeno stanovení buněčné apoptózy a nekrózy pomocí komerčního kitu Cell Death Detection ELISA (Roche, Mannheim, Germany).

Studium vlivu pole IVMP na linie lidského maligního melanomu. Bylo použito 8 stabilizovaných buněčných linií lidského maligního melanomu označených: WM1158, WM852, WM9, WM1617, WM164, WM35, WM902B a WM983A. Všechny jsou darem prof. M. Herlyna z Wistar Institutu (Philadelphia, PA, USA). Buněčné kultury byly kultivovány v médiu DMEM (PAN Biotech GmbH, Aidenbach, Německo) s přídavkem 10% fetálního telecího séra (FBS; PAN Biotech GmbH), L-glutaminu (PAN Biotech GmbH), insulinu (5 ng/ml) a antibiotik (penicilin, streptomycin) při teplotě 37°C v atmosféře s 5% CO₂ [9], [10], [11], [12].

Byly provedeny 3 paralelní pokusy a v nich stanoveny průměrné hodnoty růstu buněk maligního melanomu, které byly opakovány třikrát, po dobu 3 dnů. Reprodukovatelnost pokusů byla výborná. U linie WM852 a WM1617 dochází opakovaně po ozáření k rychlejšímu růstu buněk než u neozářeného kontrolního vzorku (neuvedeno). U ostatních 6 buněčných linií docházelo naopak k inhibici růstu do 31% . Avšak je nutno mít na paměti, že indukci resp. inhibici růstu do 15-20% lze považovat za chybu experimentu či kolísání v rámci biologické variability.
Nejvyšší inhibici růstu vykazují buňky po 24 hod. od ozáření (až 31%), po dalších hodinách inkubace při 37°C dochází pravděpodobně k jejich regeneraci a obnově růstu (inhibice růstu do 17%). Z tohoto důvodu byl proveden pokus s ozařováním dvou buněčných linií po dobu 15 minut každý den (vždy po 24 hod.), celkem 3 dny. U náhodně vybraných linií došlo k mírné inhibici růstu, 2 a 9%, až třetí den, tj. celkem po 3 ozářeních. Lze předpokládat, že buněčné linie z jiných nádorů by mohly reagovat výrazněji, tedy vyšší inhibicí růstu. Aby se mohlo zjistit, zda je inhibice růstu po ozáření způsobena vyvoláním apoptózy, jako je tomu např. u ionizujícího záření, nebo dochází k prostému rozpadu buněk nekrózou, byly ozářeny 2 buněčné linie (WM164 a WM35). Po inkubaci při 37°C po dobu 4 a 16 hod. se stanovila v buňkách apoptóza a nekróza. U obou linií nedošlo v žádném intervalu k vyvolání apoptózy, ale u buněk linie WM164 se projevila slabá nekróza již po 4 hodinách. Kmitočet impulsů f=15 Hz, šířka impulsů T=1 ms, resistance cívek R = 2Ω, I_imp = 0,7 A, těsná blízkost budičů od testovaného média. Výsledky ozařování jsou v následujícím obrázku.

Zhodnocení: Z pokusů s buňkami lidského maligního melanomu nelze učinit jednoznačný závěr, že tento druh záření zejména inhibuje růst buněk. Je zapotřebí větší rozsah pokusů na větším souboru buněčných linií. Po ozáření lidského kožního maligního melanomu došlo u 75% buněčných linií k inhibici růstu do 31%. Z toho u 66% buněčných linií byla inhibice růstu nízká (maximálně do 20%), což lze považovat za chybu pokusů a kolísání v rámci biologické variability. Indukce růstu po ozáření v průměru o 41% byla pozorována u 25% buněčných linií maligního melanomu (zde neuvedeno). Zejména fakt, že buňky lidského kožního maligního melanomu jsou rezistentní k radioterapii i k chemoterapii je důrazným popudem v dalším experimentálním výzkumu.

Z hlediska splnění základního cíle, tj. doložení existence pole IVMP jsme začali předpokládat, že buněčné linie z jiných nádorů by mohly reagovat výrazněji na jeho působení, tedy vyšší inhibicí růstu. Proto byly vybrány k ověření působení tohoto pole linie karcinomu mléčné žlázy, které byly v dané době k dispozici. Byly použity 2 buněčné linie karcinomu mléčné žlázy označené jako ZR 75-1 a PMC 42. Zde jsou uvedeny pouze výsledky dokumentující nejvýznamější rozdíly mezi působením obou silových polí a ozařováním normálních a nádorově transformovaných buněk [13].

Studium vlivu pole IVMP na karcinogenní buňky mléčné žlázy. Graf inhibice růstu linií ZR 75-1 a PMC 42 karcinomu mléčné žlázy v závislosti na čase po ozáření polem IVMP je uveden na Obr.6. Doba ozařování vždy 15 minut. Kmitočet impulsů f=15 Hz, šířka impulsů T=1 ms, resistance cívek R = 2Ω, I_imp = 0,7 A, těsná blízkost budičů od testovaného média.

Studium vlivu pole IVMP na kontrolní epitel zdravé mléčné žlázy (NME). Graf inhibice růstu kontrolního epitelu zdravé mléčné žlázy v závislosti na čase po ozáření polem IVMP je uveden na Obr.7. Doba ozařování vždy 15 minut. Kmitočet impulsů f=15 Hz, šířka impulsů T=1 ms, resistance cívek R = 2Ω, I_imp = 0,7 A, těsná blízkost budičů od testovaného média.

Studium vlivu impulsního magnetického pole na karcinogenní buňky mléčné žlázy. Pro ověření, zda není vliv impulsního magnetického pole na karcinogenní buňky podobný efektu pole IVMP bylo uskutečněno ozařování impulsním magnetickým polem za stejných podmínek jako v předchozích případech. Kmitočet impulsů f=15 Hz, šířka impulsů T=1 ms, resistance cívek R = 10Ω, I_imp = 0,7 A, těsná blízkost budičů od testovaného média. Grafy inhibice růstu jsou uvedeny na Obr.8.

Zhodnocení: Výsledky ozařování karcinogenních buněk mléčné žlázy jsou velmi povzbudivé pro další výzkum. Zejména je zřejmý efekt inhibice růstu buněk vlivem pole IVMP (Obr.6) ve srovnání s vlivem impulsního magnetického pole (Obr.8). Nečekaným, ale velmi pozitivním výsledkem je téměř zanedbatelný vliv pole IVMP na zdravé buňky (Obr.7).

© ENJOY spol. s r.o. 2010 | mapa stránek | info@enjoy.cz