Metoda měření chemiluminiscence doprovázející respirační vzplanutí fagocytů

Profesionální fagocyty představují klíčový obranný mechanismus proti invadujícím mikrobiálním patogenům. Neutrofily jsou prvními buňkami infiltrujícími po infekci zánětlivou oblast, které jsou později následované aktivovanými monocyty, makrofágy a eosinofily. Bakterie jsou ještě před tím, než jsou pohlceny fagocyty, opsonizovány sérovými imunoglobuliny a (nebo) složkami komplementu. Po opsonizaci bakterie adherují na specifické povrchové receptory fagocytů a jsou uzavřeny uvnitř vnitrobuněčného membránového tělíska zvaného fagosom. Fagosom později fúzuje s lysosomy (přítomnými ve fagocytech) a bakterie jsou zabíjeny a odbourávány různými enzymatickými i neenzymatickými látkami pocházejícími z lysosomů. Mezi vysoce toxické a nejúčinnější zabíječské činitele fagocytů patří reaktivní kyslíkové metabolity ROM (Reactive Oxygen Metabolite), jako např. superoxidový aniont, peroxid vodíku a hydroxylové radikály, tvořené na vnitřním povrchu fagolysosomu. Tyto ROM vznikají z molekulárního kyslíku v procesu nazývaném respirační vzplanutí, charakterizovaném dramatickým zvýšením aktivity hexózomonofosfátového zkratu. Aktivované fagocyty redukují molekulární kyslík na superoxidový aniont pomocí elektrontransportního systému NADPH (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate)-oxidázy. Ze superoxidového aniontu vzniká peroxid vodíku, a to buď spontánní dismutací nebo v reakci katalyzované enzymy superoxiddismutázami. Peroxid vodíku slouží jako substrát pro reakci katalyzovanou myeloperoxidázou, ve které vzniká řada vysoce toxických metabolitů, včetně kyseliny chlorné.

Při uvolňování ROM vznikají elektronově excitované stavy, které při návratu do základního stavu emitují fotony. Tato emise se označuje jako chemiluminiscence (CL = Chemical Luminiscence). Protože přirozená CL fagocytů je velmi slabá, je obvykle zesilována luminofory (luminol nebo lucigenin). Předpokládá se, že lucigenin je vysoce specifický pro superoxidový aniont, a tudíž že odráží aktivitu NADPH-oxidázy. Naopak CL odvozená od luminolu je závislá na myeloperoxidázové aktivitě. Neutrofily, eosinofily a monocyty vykazují aktivitu NADPH-oxidázy i myeloperoxidázy, generují tudíž CL závislou jak na luminolu, tak na lucigeninu. Zralé makrofágy mají snížený obsah myeloperoxidázy a tedy i sníženou CL odvozenou od luminolu [5], [6], [7].

Proces oxidativního vzplanutí (nebo tvorbu reaktivních metabolitů kyslíku fagocyty) lze snadno sledovat monitorováním emise světla za použití luminometru. CL metody se staly široce rozšířenými v lékařské praxi i v základním biomedicínském výzkumu, neboť umožňují studovat:

  1. defekty procesu opsonizace, exprese povrchových receptorů na buněčných membránách, signální transdukce, degranulace lysosomů,
  2. nedostatečnou funkci fagocytů v různých onemocněních jako chronická granulomatóza nebo neutropenie,
  3. vliv složek bakteriálních buněčných stěn, endotoxinů nebo virových kapsidů na fagocytární odpověď,
  4. vliv antimikrobiálních přípravků na fagocytózu,
  5. účinky léčiv, toxických látek, látek znečišťujících životní prostředí, fyzikálních vnějších faktorů, karcinogenů apod.

Materiál a metodika

Studium vlivu impulsního magnetického a IVMP pole. K pokusům byla použita plasma obohacená o leukocyty, která byla získána z periferní krve laboratorních potkanů kmene Wistar. Plasma s leukocyty (50 µl) byla napipetována do 96 jamek kultivační desky. Biologický materiál byl vždy ozařován 15 minut, poté bylo do jamek přidáno 150 µl HBSS, 25 µl zásobního roztoku luminolu (konečná koncentrace 1 mM) a nakonec byly leukocyty stimulovány 25 µl zymosanu z kvasinek Saccharomyces cerevisiae, který byl opsonizován potkaním komplementem.

Respirační vzplanutí fagocytů bylo měřeno luminiscenční metodou. Luminiscence byla měřena v jamkách kultivačních desek při teplotě 37°C luminometrem LM 01T (Immunotech) po dobu 60 minut. Z naměřených hodnot byly sestrojeny křivky reprezentující kinetiku respiračního vzplanutí neovlivněných fagocytů ve srovnání s fagocyty ozářenými budiči impulsního magnetického pole (Bimp≈10 mT) a polem IVMP. Výsledky reprezentují průměrné hodnoty z pěti opakování. Kmitočet impulsů f=15 Hz, šířka impulsů T=2 ms, elektrické vlastnosti obou typů cívek stejné jako v předchozím případě, těsná blízkost budičů od testovaného média.

Závislost chemiluminiscenční svítivosti neovlivněných fagocytů ve srovnání s fagocyty ozářenými oběma typy polí
Obr. 4 Závislost chemiluminiscenční svítivosti neovlivněných fagocytů ve srovnání s fagocyty ozářenými oběma typy polí.

Zhodnocení: V případě působení impulsního magnetického pole je samozřejmě jeho neoddělitelnou součástí, jak již bylo konstatováno, i pole IVMP. Maximum impulsního vektorového magnetického potenciálu je však v tomto případě v rovině směru toku elektrického proudu (tj. v rovině vinutí vzduchové cívky) a proto je zřejmě účinek na respirační vzplanutí fagocytů menší než koncentrovaný účinek pole IVMP v ose toroidu. Přitom příkon do toroidních cívek byl kvůli jejich elektrickým vlastnostem pouze 20% příkonu dodávaného do vzduchových cívek. Pokles svítivosti byl v maximu křivek po ozáření impulsním magnetickým polem 40%, kdežto po ozáření IVMP až 80%.

nahoru